【成功案例】生物化學和比較轉錄組學分析鑒定紫斑牡丹中與色素形成相關的候選基因

Biochemical and Comparative Transcriptomic?Analyses Identify Candidate Genes Related to?Variegation Formation in Paeonia rockii

PMID:?28817092

雜志:Molecules

影響因子:2.861

研究背景:牡丹是木本灌木,芍藥屬牡丹組,是一種重要的傳統觀賞植物,花瓣大而有吸引力。在十個牡丹野生種中P. rockii(紫斑牡丹)白色花瓣的基部有明顯的黑色彩斑,而P. ostii(鳳丹)沒有花瓣雜色?;ǖ念伾悄档さ囊粋€重要的商業特性,花瓣顏色的多樣性可提高牡丹的觀賞價值,因此闡明P. rockii中紫斑的形成機制具有重要意義。眾所周知,牡丹的基因很大組(13–16 GB),往往具有較高的雜合度和配子體自交不親和性,在缺少完整的基因組序列的情況下,RNA測序技術是獲得基因組表達信息最有效的工具。到目前為止,幾個花青素生物合成相關基因在牡丹中已確定,但是色斑形成的分子機制還不清楚。

材料方法:

P. rockii (PR),P. ostii?(PO)和PR與PO的雜交F1代(RO),分別收集4月底到五月初5個不同開放階段的三種牡丹的花瓣進行轉錄組分析,三個生物學重復。取階段5(完全開放期)的花瓣進行形態解剖分析和色素含量分析。

技術路線:

實驗結果:

  1. 花瓣顏色測量,形態解剖分析和色素含量分析

為了確定色斑性狀的遺傳背景,利用PO和PR雜交產生F1植株(RO),所有60株F1植株在花瓣的基部都有色斑存在(Figure 1),PR的彩斑呈顯性遺傳。根據英國皇家園藝學會比色卡(RHSCC),在階段5的PR和RO的背景與PO花瓣一樣為白色,而在第5階段的PR和RO的色斑顏色有差異。PR色斑為深紫色,而RO的為紫紅色。

Figure 1.?Fully open flowers of individuals selected for sequencing.

為了闡明其色斑形成的機制,作者檢測了色素在PR, PO和RO花瓣中的空間位置。在非色斑花瓣中沒有色素細胞(Figure 2C,I,L)。相反,色素細胞主要位于色斑花瓣的上、下表皮和柵欄組織中(Figure 2F,O)。色素細胞在PR的雜色相應也位于表皮內(正面),這可能有助于PR色斑更深的顏色(圖左)。在非雜色花瓣中,表皮細胞是無色的(圖2A,B,G – K)。

Figure 2.?Cellular features of the flower materials.

HPLC分析表明,在P. rockii和F1代牡丹花瓣的色素中含有四種花青素(CY3G5G,CY3G,芍藥色素(Pn)3G5G和Pn3G)。PR的色斑顯示出“Cy > Pn”的表型,CY3G是含量最高的花青素(28.36 ± 0.063 mg/g)。RO顯示出“Pn > CY”的表型,有比較高的Pn3G5G(4.27±0.046毫克/克)和Cy3G5G(2.51±0.011毫克/克)含量。在PR和RO背景花瓣和全部的PO花瓣中沒有檢測到花青素的存在。對色斑中成分的進一步分析發現,花瓣顏色受色素種類和濃度的強烈影響,這促使作者進一步研究轉錄水平上的分子過程。

  1. 轉錄組測序和注釋

為了確定參與PR色斑形成的關鍵基因,作者利用Illumina HiseqTM?2500對PR、PO和RO進行了比較轉錄組學分析。九個文庫中總共產生了181866條unigenes,其中57913(31.84%),43307(23.81%),34125(18.76%),18986(10.44%),33409(18.37%),24154(13.28%),47410(26.07%)條unigenes分別被注釋到了NR、PFAM、SwissProt、KEGG、GO、COG和KOG數據庫中。

與KEGG數據庫比對發現這些unigenes與代謝、遺傳信息處理,生物系統和細胞過程中的130個信號通路有關。目前已知,四個次生代謝途徑與花青素相關:苯基丙酸類生物合成(250,1.04%),類黃酮合成(64,0.26%),花色素苷生物合成(4,0.02%)以及黃酮和黃酮醇的生物合成(6,0.02%)。

  1. P. rockii,P. ostii 和F1代轉錄組比較分析

根據三種樣品的特殊表達模式,將9個RNA-seq樣品中的基因表達變化分為三組(Figure 4A)。此外,RO的基因表達水平與PO更類似。為了鑒定P. rockii中彩斑形成的候選基因,進行了PR、PO和RO文庫的比較分析。PO花瓣與PR花瓣相比,基于閾值FDR<0.001和| log2Ratio | > 1,7065條unigenes被確定為差異表達基因(DEGs),包含3174個上調和3918個下調基因(Figure 4B)。PR vs. RO中有4113個DEGs,2615個上調,2332個下調。而且,有691條unigenes在所有三個組中顯示出顯著的表達差異。

Figure 4. Gene expression profiles in three differentially colored tree peonies.

三組DEGs的GO富集分析發現9191個DEGs被分類到50個功能組,包含生物學過程(20組)、細胞組分(14組)和分子功能分類(16組)。此外,還利用KEGG數據庫對DEGs進行了功能注釋分析,PO vs. PR中與色素沉著相關的四條信號通路被鑒定出來:苯基丙酸類生物合成(39DEGs,ko00940),類黃酮化合物的生物合成(DEGs,ko00941)、黃酮和黃酮醇的生物合成(DEGs,ko00944)以及花色素苷生物合成(DEGs,ko00942)。PR vs. RO中與色素沉著相關的三條信號通路被鑒定出來:苯基丙酸類生物合成(29 DEGs),類黃酮化合物的生物合成(4DEGs)和花色素苷生物合成(1DEGs)。相比之下,PO?vs.RO中鑒定了苯基丙酸類生物合成(25DEGs),類黃酮化合物的生物合成(6DEGs),黃酮和黃酮醇的生物合成(1DEGs)和花色素苷生物合成(1DEGs)四條通路。

作者對KEGG分析中鑒定的代謝通路表達譜進行了聚類(Figure 5)。參與色素沉著的四個途徑在PO中豐度較高,類黃酮生物合在PO和RO中有很高的豐度,PR中花色素苷生物合成通路有高豐度。

Figure 5. Expression profiles of 130 KEGG pathways.

以往的研究已經證明,牡丹彩斑的形成主要取決于花青素的空間生物合成(Cy和Pn)。因此,對花青素代謝途徑中核心基因的表達模式進行了詳細研究,許多基因表達水平有顯著差異(Figure 6)。

Figure 6. A detailed schematic of anthocyanin metabolism related to?flower pigmentation in PO, PR and RO.

此外,對R2R3-MYB,bHLHWD40的表達水平分析顯示在PR或RO中一些R2R3-MYB,bHLHWD40基因顯著上調(Figure 7)。為了分析在PR中與色斑形成相關的苯基丙酸類生物合成,類黃酮化合物的生物合成,黃酮和黃酮醇的生物合成和花色素苷生物合成的相互作用,構建了一個共表達網絡(Figure 8)。

Figure 7. All unigenes encoding the R2R3-MYB.

Figure 8. A co-expression network of the DEGs involved in pigmentation.

  1. 差異表達基因在不同時期表達水平的驗證

為了驗證從轉錄組數據獲得的表達譜,選取了12個色素沉著相關DEGs進行了qRT-PCR分析以評估它們在PO、PR和RO花瓣發育中的表達模式。結果表明,12個選取的DEGs的表達模式與Illumina測序獲得的表達模式相一致。

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結論:經轉錄組測序產生了181866條unigenes,包括各種參與花青素生物合成和合成調控的相關基因。暗紫色和紫紅色色斑的形成主要與花青色素(Cy)和芍藥色素(Pn)為基礎的花青素的比例有關。本文結果表明各種色斑圖案是由花青素生物合成基因的轉錄調控產生的,R2R3-MYBs轉錄譜為闡明這個特征產生的機制提供了線索。



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