豬植入前胚胎發育過程中基因間長鏈非編碼RNA的鑒定和功能分析

PMID:?27922056

雜志:Scientific?reports

影響因子:5.228

 

研究背景:隨著高通量RNA-seq技術的發展,已經在許多物種中鑒定出了大量的基因間長鏈非編碼RNA(lincRNAs)。有研究表明,一些lincRNA在植入前胚胎發育(PED)過程中發揮重要作用。豬是一種理想的生殖和生物醫學應用研究模型,然而對豬lincRNAs的研究還比較欠缺,因此需要對lincRNAs進行全面的全基因組范圍鑒定。此外,合子基因組激活(ZGA)對成功的移植前胚胎發育至關重要,因此需要對ZGA的具體分子機制進行研究。目前很少有研究報道豬PED中轉錄組的變化情況,對PED中lincRNAs的功能研究還很有限。

公共數據獲?。?/b>

從NCBI-SRA數據庫中下載得到五個豬RNA-Seq數據集,Supplementary?Table?S1中列出了RNA-seq數據編號和詳細信息。

Supplementary?Table?S1?Details?of?RNA-seq?data

技術路線:

實驗結果:

1.基于豬RNA-seq數據集的lincRNAs鑒定

本文利用5個包含豬各種組織或細胞的RNA-seq數據(Supplementary?Table?S1)對linckRNAs進行了全面鑒定。經reads?mapping和轉錄本組裝后從122,007個基因座鑒定出了195,531個轉錄本。排除已知mRNA并進一步篩選后獲得了7,618個lincRNA。

2.豬lincRNA的結構特點

作者對預測獲得的lincRNAs和Ensemble中記錄的mRNAs進行了比較,發現lincRNAs中的外顯子明顯較少(平均值:lincRNAs?2.97個、mRNAs?8.49?個;?Kolomogorv-Smirnov?Test,?P-value<2.2×10?16)(Fig.?2A)。而豬lincRNAs外顯子長度比蛋白編碼基因長(平均值:lincRNAs?484bp、mRNAs?307bp;?Kolomogorv-

Smirnov?Test,P-value<2.2×10?16)(Fig.?2B)。由于較少的外顯子數量,整體lincRNA長度小于蛋白編碼基因的轉錄本長度(平均值:lincRNAs?1338?bp、mRNAs?2842?bp;Kolomogorv-Smirnov?Test,P-value<2.2×10?16)?(Fig.?2C)。

Figure?2.?Features?of?pig?lincRNAs.

? ? ? ? 3.豬lincRNAs的低表達量和組織特異性

? ? ? ? 對不同組織和細胞系中lincRNAs的表達模式分析結果顯示lincRNAs與蛋白編碼基因相比表達量較低。為了定量評估每個轉錄本的表達特異性,作者應用依賴于Jensen-Shannon(JS)距離算法的基于熵度量法計算每個轉錄本的表達特異性。結果顯示,lincRNAs比蛋白編碼基因表現出更高的JS平均值(Fig.?3B),這說明lincRNAs比蛋白編碼基因有更高的組織特異性。

Figure?3.?Characteristics?of?pig?lincRNAs?expression.

? ? ? ? 4.lincRNAs與鄰近蛋白質編碼基因之間潛在的順式作用關系

? ? ? ? 研究表明,lincRNAs可能通過正、負兩種方式調節鄰近蛋白編碼基因表達。通過GO分析發現豬lincRNAs的鄰近蛋白編碼基因被富集到“轉錄調控”功能。對lincRNA與鄰近蛋白編碼基因的轉錄起始位點(TSSs)距離的分析發現了462個TSSs距離在4kb以內的lincRNA:mRNA對。值得注意的是lincRNA:mRNA對中32%的lincRNAs始于400nt內,而mRNA:mRNA對只有12%(Fig.?3D)。這些結果說明豬的lincRNAs可以順式調節他們鄰近蛋白編碼基因的表達。

5.植入前胚胎發育相關lincRNAs的功能分析

過濾除去每個胚胎發育階段的低方差lincRNAs和mRNAs后,進行了共表達網絡分析(WGCNA)探索豬PED過程中lincRNA的作用。通過無監督聚類分析鑒定出了23個共表達模塊(Fig.?4A)。其中5個模塊顯示發育階段特異性(Fig.?4B),它們可能代表每一個過渡階段的核心基因網絡。為了進一步預測lincRNAs在豬PED過程中發揮的功能,作者對每個階段特異性模塊進行了GO富集分析,發現對應ZGA的4細胞到8細胞轉變階段的模塊被富集到轉錄調控、表觀調控和細胞周期條目中(Fig.?4C)。

Figure?4.?Function?prediction?of?PED?associated?lincRNAs.

? ? ? ? 6.豬植入前胚胎發育樞紐?linckRNA的鑒定

? ? ? ? 為了鑒定豬PED中的樞紐linckRNA,作者利用WGCNA測量了模塊內的基因間連接,并提取了每個階段特異性模塊中的前100個樞紐基因。然后在4細胞階段特異性模塊中的樞紐基因集中選取10個lincRNAs進行了qRT-PCR分析,發現這些lincRNAs在生殖組織中作為一個整體表達(Fig.?5A)。研究還發現在卵巢中高表達的兩個lincRNAs:tcons_00166370tcons_00020255?在4細胞階段顯示出明顯的激活趨勢,而8細胞階段迅速下調(Fig.?5B)。盡管這些參與豬PED過程的lincRNAs的作用機制還不清楚,樞紐lincRNAs的鑒定為進一步的功能研究提供了寶貴的資源。

Figure?5.?The?expression?of?two?hub?lincRNAs?from?4-cell?stage-specific?module?in?different?tissues?and?PED.

結論:進行了完整的豬lincRNAs分析,提供了首個豬植入前胚胎發育相關lincRNAs圖譜。WGCNA分析顯示PED相關lincRNAs與細胞周期調節、轉錄和表觀調控過程有關。對樞紐lincRNAs的qRT-PCR分析發現了兩個與PED密切相關的lincRNA:TCONS_00166370?和TCONS_00020255。



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