【成功案例】云平臺深度解析-小麥與禾谷胞囊線蟲在侵染初始階段的轉錄組學變化

云平臺深度解析小麥與禾谷胞囊線蟲在侵染初始階段的轉錄組學變化

Transcriptional responses of wheat?and the cereal cyst nematode?Heterodera?avenae during their?early contact stage

小麥與禾谷胞囊線蟲在侵染初始階段的轉錄組響應

雜志:?Scientific Reports?

影響因子:4.259

PMID:29101332

 

研究背景

植物寄生線蟲(PPNs)已給許多植物帶來了巨大損害。禾谷胞囊線蟲Wollenweber隸屬禾谷胞囊線蟲(CCNS),出現在80%的中國小麥種植區,致使小麥感染并減產30%到100%。許多寄生線蟲可繁殖幼蟲,幼蟲用感官定位宿主,這種復雜的行為與感官能力(如嗅覺、味覺、溫濕度感應)有關??稍谥参锔颗c線蟲初始接觸過程中采取措施進行預防,因此了解寄生蟲宿主互作機制具有重要意義。過去大部分研究集中在線蟲侵染宿主后不同階段的轉錄組學分析,而沒有關于侵染前(早期接觸階段)互作機制的探討。今年11月3日中國農業科學院作物科學研究所的老師們在Scientific Reports 發表了一篇關于小麥和禾谷胞囊線蟲在接觸早期轉錄響應機制的研究,填補了國內外研究空白,第一次對小麥和禾谷胞囊線蟲互作早期轉錄組響應進行了系統性的描述。

 

材料和方法

實驗組:Wenmai19小麥幼苗(根長2–3 cm )與J2s;對照組:僅Wenmai 19小麥幼苗或僅J2s。

處理3h后提取RNA測序。實驗組小麥根尖染色鏡檢。每組三個重復。測序后分別對小麥和線蟲DEGs進行了鑒定注釋,并對線蟲的效應基因進行了預測及BT-PCD驗證。

測序平臺:百邁客HiSeq4000測序平臺

分析平臺:百邁客云平臺(BMKCloud)

研究結果:

1.轉錄組分析采樣時間點確定

CCN易感小麥品種Wenmai19吸引禾谷胞囊線蟲J2s。小麥根尖周圍聚集的J2線蟲數量在3h達到峰值,且J2s未滲入根內部。選擇此時小麥根、線蟲樣品進行轉錄組分析。

2.小麥根尖轉錄組數據

實驗組、對照組小麥根尖樣本共得到52.23 Gb的clean reads,每個樣本≥8.25Gb,Q30≥90.4%。每個樣品的clean reads與小麥參考基因組比對效率為64.0%至67.3%,并與唯一或多基因組位置匹配(表1)。小麥轉錄組中,共發現109,496個unigenes,包括9152個新基因。與Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG等數據庫比對后,共注釋了6,780個新基因。數據重復性較好。

表1 小麥參考基因組比對結果

3.小麥基因表達響應分析

實驗組、對照組基因表達分析得到93個差異表達的unigenes(66個下調,27個上調),FDR<0.05和FC≥1.5(圖1)。對12個DEGs進行了qPCR驗證,其中11個DEG的表達模式與mRNA測序結果一致。結果表明即使未受感染,J2線蟲在小麥根部聚集也會觸發小麥的響應。

圖1 實驗組對照組小麥DEGs的火山圖

功能注釋的結果表明,所有的DEG都能與Nr數據庫比對上,其中一些在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG數據庫中也有注釋信息(表2)。

表2 小麥與禾谷胞囊線蟲的DEGs的功能注釋

GO富集分析將小麥DEGs分為28個功能組,歸為3大類:生物學過程(60個)、細胞成分(54個)、分子功能(68個)(圖2a)。

圖2a小麥根尖unigenes 和DEG unigenes的GO分類

在生物過程類別中,與所有小麥根的unigenes相比,大部分DEG與代謝過程、單一生物過程、對刺激的反應相關。細胞成分類別中更多DEGs位于細胞外區域。 在分子功能類別,與所有unigenes相比,DEG更多富集于營養儲存活性,抗氧化活性,電子載體活性,酶調節活性和催化活性等GO分類。

KEGG通路分析來確定DEGs的生物學功能。將31個DEG分配到21個KEGG通路(圖3a)。最多數量DEGs歸類于苯丙素生物合成通路,其次是谷胱甘肽代謝,苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝。6個DEG與苯丙烷相關通路有關,在線蟲侵染的小麥根中全部下調,其中兩個基因Traes_1AS_F9013A945和Traes_2AS_EE549925C,經qPCR驗證有相似的表達模式。

圖3a.小麥根尖DEGs的KEGG分析

COG注釋后,小麥29個DEGs被分為6個COG功能類別,包括能源產生于轉換;次級代謝物合成運輸和代謝;僅一般功能預測;翻譯后修飾、蛋白質轉換,分子伴侶;氨基酸轉運代謝;碳水化合物轉運代謝(圖4a)。

圖4.DEGs的COG功能注釋 a 小麥根系 b禾谷胞囊線蟲

4.小麥DEGs生物脅迫通路圖譜

MapMan分析顯示小麥許多DEGs能比對到生物脅迫通路(圖5):29個小麥DEGs能和生物脅迫通路相關的33個數據點比對上,DEGs包含過氧化物酶,谷胱甘肽S轉移酶,激素信號傳導(生長素和茉莉酸),發病相關蛋白和次級代謝物。這些DEGs大多數在生物脅迫通路中表達下調。qPCR分析其中8個DEGs,除一個之外,其他的表達模式與測序結果一致。

圖5.小麥DEGs生物脅迫通路

在氧化還原反應通路中,3個DEGs與過氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉移酶通路比對上,且全部下調,表明氧化還原反應減弱。在激素信號傳導通路中,生長素和茉莉酸(JA)通路各包含2個下調的DEGs。

有7個數據點與6個下調的DEGs比對上,幾乎都與苯丙素類黃酮代謝通路有關。編碼PR蛋白的防御基因有3個下調的DEG,1個下調的DEG,與細胞壁蛋白比對上,1個表達上調的DEG與細胞壁修飾通路有關。

2個下調的DEG,2個上調的DEG可比對到蛋白酶和泛素相關蛋白水解通路。

1個上調的DEG與突發性呼吸相關,隸屬乙烯應答元件結合蛋白家族的轉錄因子,可比對到Traes_5DL_41E3B1B23基因,是一個上調DEG(注釋ERF071)。

5.CCN的轉錄組數據

實驗組、對照組CNN樣本得到30.47Gb的clean reads,每份樣本≥4.13Gb,Q30≥89.1%。共得到194,662個轉錄本和80,124個unigenes(表3)。unigenes的總長、N50長度、平均長度分別為61,659,712bp,955bp、769.55bp。長于1 kb的unigenes有15,197個。每個CCN樣本與組裝數據的比對效率在73.2%至79.2%之間。根據Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam數據庫,共注釋了43741個unigenes。CCN樣本重復性良好。

表3 禾谷胞囊線蟲的組裝轉錄本及unigene一覽

6.CCN基因對于小麥根吸引的響應分析

實驗組、對照組CNN比較得到879個DEGs(FDR <0.01和FC≥2)。867個上調,僅12個下調。對10個DEG的表達模式進行qPCR驗證,結果與測序結果一致。表明CCNs通過小麥根的刺激激活,大部分基因上調。

DEGs的功能注釋,GO富集分析把258個DEGs歸類到三大類的36個功能組中:生物過程(159個)、細胞成分(107個)、分子功能(223個)(圖2b)

圖2b 禾谷胞囊線蟲unigenes 和DEG unigenes的GO分類

KEGG分析將247個DEGs歸到125個KEGG路徑,50個最顯著的通路中,核糖體通路有最多的DEG數(64個)(圖3b),其他DEG較多的通路為細胞色素P450外源物代謝,谷胱甘肽代謝和Toll樣受體信號通路。表明CNN被小麥根部吸引時CNN的蛋白翻譯更活躍。

圖3b.禾谷胞囊線蟲DEGs的KEGG分析

共386個DEGs歸類于22個COG功能類別。前四個DEG數目最多的COG類別為僅一般功能預測(90個);翻譯,核糖體結構和生物起源(65個);能量產生與轉化(45個);氨基酸轉運代謝(44個)(圖4b)。

7.CNN效應基因預測

搜集PPNs的351個已知效應子基因序列,并將CCN的DEGs與這些序列進行比對。推測6個DEG與已知效應基因14-3-3,幾丁質酶,β-1,4-內切葡聚糖酶,果膠酸裂解酶或組織蛋白酶具有同源性(表4)。比對上的效應基因的描述和DEG的Nr注釋一致。對這些DEGs結構域進行了預測,結果也與基因描述一致(圖6,表4)。當J2線蟲與小麥根接觸時,編碼候選效應蛋白的DEGs全部上調。

表4.根據禾谷胞囊線蟲DEGs預測的效應基因

圖6 禾谷胞囊線蟲的6個候選效應基因的結構域

8.效應基因的植物防御抑制驗證

選擇兩個預測的效應基因c68622.graph_c0和c72543.graph_c0,在本氏煙草中進行程序性細胞死亡(BT-PCD)抑制來驗證其抑制植物防御的能力。

BAX加入后,在c68622.graph_c0,沒有明顯壞死,而c72543.graph_c0則明顯壞死(圖7)。BT-PCD抑制試驗的兩個重復結果一致。表明前者抑制BT-PCD,而后者不抑制。c68622.graph_c0是來自H.avenae DEGs的候選基因,可能在抑制植物防御中發揮作用。

圖7.(a)c68622.graph_c0和(b)c72543.graph_c0在本氏煙草中BT-PCD的試驗

結論:

本文擬研究在線蟲與小麥根部在早期接觸階段的相互作用機制,通過mRNA測序對小麥和禾谷胞囊線蟲在接觸早期的轉錄組響應進行了分析,鑒定了的宿主小麥根部的93個DEGs(27個上調,66個下調),寄生線蟲的879個DEGs(867個上調,12個下調)。其中一些小麥DEGs(主要是下調的)與生物脅迫途徑相關,線蟲DEGs中幾個推定的效應基因表達上調,線蟲的幾丁質酶樣效應基因能抑制本氏煙草中BAX引起的細胞程序性死亡。以上結果表明,在寄生初始接觸階段,線蟲的響應比小麥更活躍。寄生蟲的響應主要與基因(包括至少一個抗植物防御效應基因)的上調相關,而宿主響應主要與某些防御基因下調相關。

 

 

創新點

第一個對小麥和禾谷胞囊線蟲互作早期轉錄組響應進行系統性描述的研究。

參考文獻:

Chen C, Cui L, Chen Y, et al.?Transcriptional responses of wheat and the cereal cyst nematode Heterodera avenae during their early contact stage[J]. Scientific Reports, 2017, 7:14471.



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