外源細胞分裂素和脫落酸響應的荔枝果皮轉錄組分析

發表雜志:Plant Growth Regulation

影響因子:2.646

摘要

荔枝(Litchi chinensis?Sonn.)是一種重要的水果作物,起源于中國,并在世界熱帶和亞熱帶地區商業化種植。荔枝紅色果皮的顏色是荔枝果實市場接受度的重要品質,果皮的粉紅色/紅色是花青素生物合成和積累的結果,花青素-3-葡萄糖苷和花青素-3-蕓香糖苷是荔枝紅果皮中的主要花青素。荔枝花青素的數量和組成在不同的品種間差異很大,也很大程度上受各種環境因素的影響。因此,深入了解荔枝中花青素生物合成的調控具有重要的科學意義和經濟意義。

許多研究表明,花青素生物合成很大程度上受植物激素的影響。外源脫落酸(ABA)處理促進荔枝花青素生物合成,而外源性N-(2-氯吡啶-4-基)-N’-苯基脲(CPPU)抑制荔枝花青素生物合成。但是,ABA或CPPU調控花青素生物合成的機制仍不清楚。為了進一步了解外源ABA和CPPU調控荔枝果實花青素生物合成的分子基礎,華南農業大學園藝學院趙杰堂老師課題組對ABA或CPPU處理的荔枝果皮進行轉錄組測序,并進行了全面的分析。

材料和方法

選取生長十五年的L. chinensis?cv,妃子笑。 三種處理方式:ABA處理,CPPU處理和對照處理(自來水),每組處理約15個果實簇。處理后分別取0,10和20天果皮圓盤,共取7組樣本分別是:Cont-0,Cont-10,Cont-20,ABA-10,ABA-20,CPPU-10,CPPU-20,分別提取總RNA,用于RNA測序。

測序平臺:北京百邁客生物科技有限公司Illumina Hiseq平臺?150PE

分析平臺:百邁客云平臺(BMKCloud)

分析內容:1.原始數據質控;2.參考基因組比對(未發表);3.差異表達基因分析(韋恩圖繪制,KEGG富集分析);4.基因功能注釋(使用Blast2Go 基于Nr,Nt,COG,KO,GO數據庫的最高相似性進行基因注釋);5.統計分析

花青素和葉綠素含量的測定以及內源ABA分析

研究人員根據Wrolstad(1982)等人的描述進行相應的修改對果皮中總花青素含量進行定量,根據Arnon(1949)描述的方法計算總葉綠素含量,根據Jia(2011)等人所述,進行了一些修改,使用氣相色譜 – 質譜(GC-MS)測定ABA含量,每個過程重復三次。

結果

1.經外源ABA和CPPU處理后,荔枝果皮的表型、色素含量和內源ABA水平的變化

處理10天后,ABA處理和對照處理的果實開始著色(圖1a),盡管花青素含量沒有顯著差異(圖1b)。然而,CPPU處理的果實只有一點點紅色(圖1a),并且花青素含量遠遠低于ABA處理和對照的果實(圖1b)。處理后20天,ABA處理的果實變成均勻的紅色,并且CPPU處理的果實仍然是綠色的,帶有一點紅色(圖1a)。同時,對照果實呈現不均勻的紅色(圖1a),這是cv妃子笑的典型特征。如圖1b所示,ABA處理20天后明顯促進荔枝果皮花青素積累,而CPPU處理顯著抑制荔枝果皮花青素積累。與花青素含量變化相反,果實成熟過程中葉綠素含量降低。顯然,ABA處理加速葉綠素降解和CPPU處理延緩了這一過程(圖1c)。ABA處理的果實與對照之間的內源ABA水平沒有顯著差異,而CPPU處理的果相比而言具有較低的ABA水平(圖1d)。

圖1.各處理組果皮顏色、花青素、葉綠素及ABA含量變化

2.RNA測序以及參考基因組比對

共構建7個文庫,測序過濾后每個樣本數據均不低于6.6Gb,平均GC含量為45.36%(表1)。與荔枝參考基因組比對(未發表),比對率是74.7%(表1)。

表1. RNA-Seq結果展示

3.外源ABA和CPPU處理后荔枝果皮基因表達譜的綜合分析

三種處理后0天,10天和20天的荔枝果皮中發現了許多差異表達轉錄本(圖2)。荔枝果皮色素沉著過程中,在對照組鑒定了2263個差異表達基因(DEGs)(圖2a)。除此之外, 經過ABA(圖2b)和CPPU(圖2c)處理后的三個階段分別鑒定了1986和2862個DEGs。

圖2.三組處理中差異表達基因韋恩圖

為了鑒定ABA和CPPU調控的花青素生物合成的DEGs,分別選擇ABA / CPPU處理后10天和20天的DEGs與對照組進行比較。 與對照相比,在ABA和CPPU處理的果皮中分別有579和827個DEGs。 表達模式分析表明,在ABA處理10天和20天后,上調的轉錄本數量均比下調的轉錄本數量多。而 CPPU處理后20天上調的轉錄本數量比ABA處理的低很多。

4.外源ABA處理后的荔枝果皮表達分析

外源ABA處理組,對顯著差異表達的基因進行GO分析,發現了與細胞過程,代謝過程,細胞,細胞部分,催化活性和轉運蛋白活性有關的GO terms的富集。也做了DEGs的KEGG通路富集分析。 579個DEGs中的351個被富集到101個通路中,前5個通路組分別為:植物 – 病原體相互作用通路(49DEGs),植物激素信號轉導(32DEGs),類黃酮生物合成(27DEGs),內質網中的蛋白質加工(27DEGs) 碳代謝(20 DEGs),淀粉和蔗糖代謝(20 DEGs)。

外源ABA處理的DEGs中,大部分與花青素合成有關的DEGs上調,如PAL,C4H,CHS,CHI,DFR,LDOX和GTs。此外, FLS和LAR等黃酮醇和原花青素合成基因上調, C3’H,COMT,F5H,CCR,CAD等木質素合成基因也上調了。 ABA處理后另一類顯著差異表達的unigene參與植物激素代謝和信號傳導。兩個編碼ABA生物合成途徑中的關鍵酶的NCEDs unigenes顯著上調,而ABA信號轉導的基因在外源ABA處理后沒有明顯的變化。外源ABA處理也影響了與生長素信號途徑有關的基因表達。例如,屬于Aux / IAAs家族的兩個unigenes上調。另外,編碼DELLA蛋白,負調控GA信號轉導的unigenes經ABA處理后上調。

5.外源CPPU處理的荔枝果皮表達分析

將CPPU處理組與對照組之間的DEG進行GO分析。 與外源ABA處理相比,差異不顯著。KEGG富集分析, 897個DEGs中的493DEGs個被富集到117個通路,前六個通路組是碳代謝(54DEGs),植物 – 病原體相互作用(49DEGs),光合作用(42DEGs),氨基酸生物合成(38DEGs),苯丙素生物合成 (33DEGs),植物激素信號轉導(32DEGs)。

與ABA處理不同的是,外源CPPU處理后許多上調基因參與碳代謝,氨基酸生物合成和光合作用的基因,特別是在CPPU處理后10天較明顯。例如,unigene Litchi__GLEAN_10019646在外源CPPU處理10天后顯著上調6.1倍,它編碼捕光復合體II葉綠素a / b結合蛋白1。另外一類在外源性CPPU處理中顯著差異表達的unigenes涉及葉綠素生物合成代謝。 CPPU處理后,大部分參與類黃酮和花青素生物合成的DEGs均下調,如PAL,C4H,CHS和LDOX。此外,黃酮醇和原花青素合成基因,如FLS和LAR也下調。有29個DEGs比對到植物激素信號轉導途徑。其中,ABA信號中的兩個ABA受體PYR / PYL均被CPPU下調。另外,與生長素,GA和乙烯信號有關的基因大部分也下調。

6.ABA和CPPU處理的荔枝果皮的表達分析

受外源ABA和CPPU共同響應的DEGs共199個,其中大部分unigenes在兩種處理組中顯示出類似的改變。 值得注意的是,有10個unigenes在轉錄水平上表現出相反的模式。 其中,編碼GST4蛋白的unigene(Litchi_GLEAN_10051861)被報道與荔枝中花青素的液泡轉移有關。

ABA處理和CPPU處理之間的顯著差異之一是葉綠素代謝。 鑒定了與葉綠素生物合成和降解有關的24個候選基因,其響應外源ABA和CPPU的表達模式如圖3所示??傮w而言,ABA處理對葉綠素生物合成和降解的基因表達沒有顯著影響。 與對照相比,CPPU處理顯著提高大多數葉綠素合成基因,并下調TF SGR。

圖3.兩種處理后荔枝果皮中葉綠素生物合成和降解相關差異表達基因熱圖

 

經外源ABA處理和CPPU處理的一些涉及類黃酮生物合成途徑的unigenes的表達有不同的改變(圖4)。 該研究鑒定了不止一個荔枝黃酮類生物合成的結構基因,并且不同的基因家族成員表現出不同的表達模式。 根據研究人員以前的研究,選擇黃酮生物合成相關基因作進一步分析。 如圖4所示,ABA處理上調荔枝黃酮合成的結構基因,而CPPU抑制其表達,特別是PAL,CHS和F3’H。

圖4.兩種處理后荔枝果皮中黃酮類生物合成途徑相關差異表達基因概覽

7.qRT-PCR驗證

對9個顯著差異表達的基因進行qRT-PCR實驗,分別是:HEMA,CBR,DFR,CHI,UFG,chloaophyllase,RCCR和SGR。 結果顯示,RT-PCR結果與RNA-seq數據一致(圖5)。

圖5. qRT-PCR分析結果圖

結論

在褪色階段外源ABA處理提高了荔枝的顏色,而外源CPPU處理抑制了花青素的積累。 RNA-seq分析結果顯示:兩種處理組(ABA和CPPU)與對照相比,分別有579個和827個差異表達基因。外源ABA處理中,上調表達的有類黃酮和花青素合成相關基因。相反,外源CPPU處理中,誘導了與碳代謝,氨基酸生物合成和光合作用有關的基因,并下調了花青素生物合成相關基因。結果表明,ABA處理對花青素生物合成和糖代謝中涉及的基因的表達有顯著作用。 另外,ABA處理對葉綠素分解代謝相關基因無顯著影,CPPU處理顯著增加了葉綠素合成基因的表達,并抑制了葉綠素降解基因(SGR)的表達,說明外源CPPU處理通過增加葉綠素合成基因的表達和抑制葉綠素降解基因的表達來影響葉綠素分解代謝。進一步分析顯示,ABA和CPPU處理也影響其他植物激素信號傳導途徑(如生長素,GA和乙烯)中的基因表達,說明ABA和CPPU可能與其他激素信號途徑如生長素,GA和乙烯相互作用,形成一個復雜的網絡調控花青素的生物合成。

 

創新點

研究人員在前期的研究中為此項研究做了較好的鋪墊,然而,早期的研究僅關注于外源ABA和CPPU對荔枝果皮單基因或少量基因的表達。本研究采用轉錄組分析方法,了解外源ABA和CPPU處理后荔枝果皮的整體分子變化。本研究為ABA和細胞分裂素影響荔枝和其他富含花青素的果樹中花青素生物合成的機制探索提供了有價值的信息。

 

參考文獻:Hu, B., Li, J., Wang, D. et al. Plant Growth Regul (2017). https://doi.org/10.1007/s10725-017-0351-7



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